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      慢病毒

      慢病毒载体

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      慢病毒载体（Lentivirus）是一类改造自人免疫缺陷病毒（HIV）的病毒载体，，是逆转录病毒的一种，，，基因组是RNA，，，，其毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代，，属于假型病毒可将外源基因整合到基因组中实现稳定表达，，，，具有感染分裂期与非分裂期细胞的特性。。。
      　　
      　　慢病毒基因组进入细胞后，，在细胞浆中反转录为DNA，，，，形成DNA整合前复合体，，进入细胞核后，，，DNA整合到细胞基因组中。。整合后的DNA转录成mRNA，，回到细胞浆中，，，，表达目的蛋白或产生小RNA。。慢病毒介导的基因表达或小RNA干扰作用持续且稳定，，，，并随细胞基因组的分裂而分裂（图1）。。。。

      　　图1 慢病毒包装和侵染细胞的过程
      　　
      　　慢病毒载体具有宿主范围广，，免疫原性低，，基因容量大，，可以长期表达等特点。。能够有效地感染培养的肿瘤细胞、、、、肝细胞、、、心肌细胞、、神经元、、内皮细胞、、、干细胞等多种类型的细胞。。。
      　　
      　　慢病毒的感染具有整合特性，，，能够将外源基因有效地整合到宿主染色体上，，，达到持久性表达，，因而可构建稳定细胞株，，用于基因的细胞功能研究。。。。借助慢病毒载体改造T细胞可用于CAR-T细胞治疗。。。



      慢病毒包装与纯化

      　　慢病毒包装采用三质粒或四质粒系统进行包装，，，，收集细胞培养上清，，，，通过超速离心浓缩纯化和收集病毒。。。


      慢病毒滴度检测

      　　检测方法：定量PCR检测感染后细胞基因组中外源DNA拷贝数
      　　
      　　实验原理：慢病毒介导外源基因以逆转录方式整合进目的细胞基因组


      慢病毒载体优势

      ① 表达时间长：慢病毒可将外源基因整合到宿主细胞基因组上，，，实现基因长时间稳定的表达，，不随细胞分裂传代而丢失，，，是细胞实验的首选，，常用于构建稳定株。。。
      ② 安全性高：未发现致病性，，慢病毒载体改造T细胞用于CAR-T细胞治疗。。
      ③ 免疫原性低：直接注射活体组织不易造成免疫反应，，，适用于动物实验。。。。
      不同病毒的生物学特性比较
      载体选择
      　　翼扬互动生物拥有丰富的慢病毒产品，，，用于操作编码基因和非编码基因，，，如lncRNA、、、、microRNA、、、、circRNA，，，如下慢病毒载体可供您选择（不限于此列表）：
      调控方式 载体编号 载体名称（载体元件顺序） 真核抗性 荧光 启动子 默认标签 载体容量
         过表达 GL127 pSLenti-CMV-EGFP-3xFLAG-WPRE N/A EGFP CMV 3FLAG 4.8kb
      GL121 pSLenti-EF1-EGFP-CMV-MCS-WPRE N/A EGFP CMV N/A 4.4kb
      GL129 pSLenti-CMV-mCherry-3xFLAG-WPRE N/A mCherry CMV 3FLAG 4.8kb
      GL119 pSLenti-CMV-MCS-3xFLAG-PGK-Puro-WPRE Puro N/A CMV 3FLAG 4.4kb
      GL120 pSLenti-SFH-EGFP-P2A-Puro-CMV-MCS-3xFLAG-WPRE Puro EGFP CMV 3FLAG 3.5kb
      GL107 pSLenti-EF1-EGFP-P2A-Puro-CMV-MCS-3xFLAG-WPRE Puro EGFP CMV 3FLAG 3.7kb
      GL109 pSLenti-EF1-EGFP-F2A-Puro-CMV-MCS-WPRE Puro EGFP CMV N/A 3.8kb
      GL122 pSLenti-EF1-EGFP-F2A-BSR-CMV-MCS-WPRE blasticidin EGFP CMV N/A 3.9kb
      GL130 pSLenti-CMV-EGFP-3xFLAG-PGK-Puro-WPRE Puro EGFP CMV 3FLAG 3.7kb
      GL132 pSLenti-EF1-EGFP-F2A-Puro-WPRE2-CMV-MCS Puro EGFP CMV N/A 3.7kb
      GL123 pSLenti-EF1-mCherry-P2A-Puro-CMV-MCS-3xFLAG-WPRE Puro mCherry CMV 3FLAG 3.7kb
      GL125 pSLenti-CMV-mCherry-3xFLAG-PGK-Puro-WPRE Puro mCherry CMV 3FLAG 3.7kb
      GL133 pSLenti-EF1-mCherry-F2A-Puro-WPRE2-CMV-MCS Puro mCherry CMV N/A 3.7kb
      H114 pLenti-CMV-Luc2-IRES-Puro-WPRE Puro N/A CMV N/A 2.2kb
      GL124 pSLenti-EF1-Luc2-F2A-Puro-CMV-MCS-WPRE Puro N/A CMV N/A 2.8kb
       表达cre H126 pLenti-CMV-NLS-Cre-3xFLAG-WPRE N/A N/A CMV 3FLAG 3.9kb
      H15108 pLenti-CMV-DIO-MCS-WPRE N/A N/A CMV 3FLAG 5.3kb
      三标 H7656 pLenti-CBh-3xFLAG-Luc2-tCMV-mNeonGreen-F2A-Puro-WPRE Puro mNeonGreen CBh 3FLAG 1.3kb
      H7657 pLenti-CBh-3xFLAG-Luc2-tCMV-tdTomato-F2A-Puro-WPRE Puro tdTomato CBh 3FLAG 0.6kb
      H9911 pLenti-CBh-3xFLAG-Luc2-tCMV-mNeonGreen-F2A-BSR-WPRE blasticidin mNeonGreen CBh 3FLAG 1.5kb
      H9912 pLenti-CBh-3xFLAG-Luc2-tCMV-tdTomato-F2A-BSR-WPRE blasticidin tdTomato CBh 3FLAG 0.8kb
      circRNA过表达 H8384 pLenti-EF1-EGFP-F2A-Puro-CMV-S-circRNA-WPRE N/A EGFP CMV N/A 3.0kb
      H8807 pLenti-CMV-S-circRNA-WPRE N/A N/A CMV N/A 4.8kb
      H8399 pLenti-EF1-EGFP-F2A-Puro-CMV-L-circRNA-WPRE Puro EGFP CMV N/A 1.0kb
      H8810 pLenti-CMV-L-circRNA-WPRE N/A N/A CMV N/A 2.8kb
      miRNA过表达 GL109 pSLenti-EF1-EGFP-F2A-Puro-CMV-MCS-WPRE Puro EGFP CMV N/A N/A
      H3919 pCLenti-U6-miR30(miRNA)-CMV-EGFP-F2A-Puro-WPRE Puro EGFP U6 N/A N/A
      H119 pLenti-CMV-TurboGFP-IRES-Puro-miR30(miRNA)-WPRE Puro TurboGFP CMV N/A N/A
      H3928 pCLenti-U6-miR30(miRNA)-CMV-mCherry-F2A-Puro-WPRE Puro mCherry U6 N/A N/A
      H146 pCLenti-EF1-Puro-CMV-EGFP-3xFLAG-Sponge(miRNA)-WPRE Puro EGFP CMV 3FLAG N/A
      H7505 pCLenti-U6-TuD(miRNA)-CMV-EGFP-F2A-BSR-WPRE blasticidin EGFP CMV N/A N/A
      H7506 pCLenti-U6-TuD(miRNA)-CMV-EGFP-F2A-Puro-WPRE Puro EGFP CMV N/A N/A
      过表达（Tet-on） H125 pLenti-TRE-EGFP-EF1-rtTA3-IRES-Puro-WPRE Puro EGFP TRE N/A 2.0kb
      H121 pLenti-TRE-EGFP-3xFLAG-PGK-Puro-WPRE Puro EGFP TRE 3FLAG 3.3kb
      H2057 pLenti-EF1-rtTA3-IRES-Puro-WPRE Puro N/A EF1 N/A N/A
      shRNA干扰 GL401 pCLenti-U6-shRNA-CMV-Puro-WPRE Puro N/A U6 N/A N/A
      GL404 pCLenti-U6-shRNA-CMV-EGFP-WPRE N/A EGFP U6 N/A N/A
      GL427 pSLenti-U6-shRNA-CMV-EGFP-F2A-Puro-WPRE Puro EGFP U6 N/A N/A
      GL428 pSLenti-U6-shRNA-CMV-mCherry-F2A-Puro-WPRE Puro mCherry U6 N/A N/A
      H7615 pCLenti-U6-shRNA-CMV-mCherry-F2A-BSR-WPRE blasticidin mCherry U7 N/A N/A
      CRISPR敲除 H5070 pLenti-U6-spgRNA v2.0-CMV-Puro-P2A-3xFLAG-spCas9-WPRE Puro N/A U6 N/A N/A
      H7072 pLenti-U6-spgRNA v2.0-CMV-BSR-P2A-3xFLAG-spCas9-WPRE blasticidin N/A U6 N/A N/A
      H6825 pLenti-U6-spgRNA v2.0-CMV-sfGFP-P2A-3xFLAG-spCas9-WPRE N/A sfGFP U6 N/A N/A
      H5068 pLenti-U6-spgRNA v2.0-CMV-EGFP-WPRE N/A EGFP U7 N/A N/A
      H5450 pLenti-CMV-Puro-P2A-3xFLAG-espCas9_1.1-WPRE Puro N/A CMV 3FLAG N/A
      CRISPRa转录激活 H9517 pCLenti-U6-gRNA-MS2-EFS-dCas9-VP64-T2A-BSD-WPRE blasticidin N/A U6 N/A N/A
      E2577 pCLenti-EF1a-MCP-P65-HSF1-T2A-Hygro-WPRE hygromycin N/A EF1a N/A N/A
      H7284 pCLenti-U6-gRNA-2x(wt+f6)MS2-CMV-MCP-P65-HSF1-IRES-BSR-WPRE blasticidin N/A U6/CMV N/A N/A
      H7281 pLenti-CMV-dCas9-VP64-T2A-Puro-WPRE Puro N/A CMV N/A N/A


      常规应用

      　　体外感染细胞
      　　
      　　慢病毒载体能够有效地感染培养的肿瘤细胞、、、、肝细胞、、、、心肌细胞、、、神经元、、内皮细胞、、、、干细胞等多种类型原代细胞和大部分细胞系。。。。
      　　
      　　慢病毒的感染具有整合特性，，，，能够将外源基因有效地整合到宿主染色体上，，，因而可以达到持久性表达，，从而构建稳转细胞株，，，体外进行细胞功能学实验，，，，包括细胞增殖、、、侵袭、、迁移、、、凋亡等研究。。稳定表达目的基因的肿瘤细胞株还可以进一步构建肿瘤动物模型，，，，进行体内基因功能验证，，，，药效药代，，，，活体成像等检测，，，，进一步研究体内肿瘤发生、、、发展和转移及药物治疗的效果。。。。
       


      　　常见MOI列表
      细胞名 中文名称 慢病毒感染MOI
      （参考值）
      MGC80-3 人胃癌细胞 10
      HT-29 人结肠癌细胞 20
      RKO 人结肠腺癌细胞 10
      Caki-1 人肾透明细胞癌皮肤转移细胞 10
      5637 人膀胱癌细胞 10
      U-118 MG 人脑星形胶质母细胞瘤 10
      RWPE-1 人正常前列腺上皮细胞 20
      HeLa 人宫颈癌细胞 10~20
      Ca Ski 人宫颈癌肠转移细胞 10
      MCF7 [MCF-7] 人乳腺癌细胞 10
      A549 人非小细胞肺癌细胞 10
      NCI-H1299 人非小细胞肺癌细胞 20
      U-87 MG 人脑星形胶质母细胞瘤 10
      U251 人胶质瘤细胞 10
      A172 人胶质母细胞瘤细胞 10
      K-562 人慢性髓原白血病细胞 10
      HL-60 人原髓细胞白血病细胞 10
      GES-1 人胃上皮细胞 20
      U266 人骨髓瘤细胞 20
      CAL 27 人舌鳞癌细胞 20
      PC9 人肺癌细胞 5
      PC14 人肺癌细胞 10
      MADB-106 大鼠乳腺癌细胞 20
      F98 大鼠脑胶质瘤细胞 20
      MHCC-97H 人肝癌细胞（高转移） 10~20

      　
      　　MOI 是multiplicity of infection 的缩写，，，即感染复数，，，，其含义是感染时病毒与细胞的数量比值，，一般以实验中某个细胞，，，，感染达到80%，，，，定义为这个细胞的MOI值，，，，即病毒量与细胞数的比值；加的病毒量(μl)=细胞数×MOI/滴度(…/ml) ×1000


      慢病毒在肿瘤研究中的应用案例
       
      1.Nature Communications. (IF=12.353). Shi Y,et.al. (2017). Tumour-associated macrophages secrete pleiotrophin to promote PTPRZ1 signalling in glioblastoma stem cells for tumour growth.[慢病毒, 胶质细胞瘤]
      慢病毒干扰： Lenti-shNT/shPTN/shPTPRZ1
      2. Hepatology. (IF=14.079). Ma JZ,et.al. (2016). METTL14 suppresses the metastatic potential of HCC by modulating m6 A-dependent primary miRNA processing. [慢病毒, 肝癌]
      慢病毒过表达/干扰：pLV-CMV-PGK-EGFP-T2A-puro/ pLV-U6-shRNA-CMV-EGFP-T2A-puro
       
      慢病毒在神经系统的应用（在体注射）
      1．Nature Neuroscience. (IF=19.912). Ding XL,et.al. (2017). Activity-induced histone modifications govern Neurexin-1 mRNA splicing and memory preservation. [慢病毒, 学习与记忆]
      病毒类型：慢病毒
      载体名称：LV-Suv39h1-RNAi（不确定详细的）
      注射部位：海马DG区
      病毒注射量：2 μL，，9.98 × 108 TU/mL
      检测时间：2周
       
      2．Nature Communications. (IF=12.353). Yao XH,et.al. (2016). Electrical coupling regulates layer 1 interneuron microcircuit formation in the neocortex. [慢病毒, 神经环路]
      病毒类型：慢病毒
      载体名称：LV- CX36-shRNA-EGFP（不确定详细的）
      注射部位：P1小鼠新皮层L1
      病毒注射量：1μL
      检测时间：2周
      3．Molecular Psychiatry. (IF=11.64). Guo DJ,et.al. (2019). Autism-like social deficit generated by Dock4 deficiency is rescued by restoration of Rac1 activity and NMDA receptor function. [慢病毒, 自闭症]
       
      病毒类型：慢病毒
      载体名称：Lenti-CMV-EGFP-P2A-3FLAG-Rac1
      注射部位：小鼠海马CA1区
      病毒注射量：1μL
      检测时间：4周
       
      慢病毒延伸服务
       
      翼扬互动生物慢病毒的生产和质控采取了国际学术界公认的标准流程，，，采用三质粒或四质粒系统在293T细胞中进行包装。。。所获得的病毒颗粒经过超速离心纯化，，，，并通过qPCR对病毒基因拷贝进行滴定。。一般情况下我们的慢病毒的滴度在108~109TU/ml，，完全可以满足各类实验的使用要求。。
      咨询服务热线：021-58585887   联系人：姜女士    联系电话：13501676670 联系邮箱：jxl@aiicdn.com
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